Những chiến lược này phụ thuộc rất nhiều vào việc tiếp cận các phương pháp phát hiện mầm bệnh chính xác, nhanh chóng và nhạy cảm như xét nghiệm PCR định lượng và thời gian thực (qPCR). PCR (Polemerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi polymerase) là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Và có nhiều xét nghiệm PCR được phát triển để phát hiện tất cả các tác nhân gây bệnh chính của tôm. Trong trường hợp cần thử nghiệm không phá hủy - như kiểm tra tôm bố mẹ về sự hiện diện của vi-rút và các mẫu nhiễm bệnh - mẫu mang, vỏ hoặc chất lỏng của tôm là các nguồn thực tế duy nhất để thử nghiệm.
Vi-rút có liên quan đến mang (GAV) - còn được gọi là kiểu gien vi-rút đầu vàng tuýp 2 (YHV2) - phổ biến rộng rãi ở tôm sú tự nhiên và tôm sú nuôi (Penaeus monodon) của Úc. Ở Úc, con người ngày càng quan tâm đến việc thiết lập quần thể giống P. monodon sạch bệnh hoặc kháng bệnh GAV. Cả hai đều yêu cầu phát hiện và định lượng chính xác mẫu bệnh nhiễm GAV, và mô mang hoặc mô vỏ thường được sử dụng để phân tích RT-PCR. Tuy nhiên, việc mức độ nhiễm bệnh GAV có thể khác nhau giữa các dải mang hoặc vỏ khác nhau lấy mẫu từ cùng một con tôm hầu như vẫn chưa được xác định.
Bài viết này tóm tắt kết quả của một nghiên cứu sử dụng phân tích RT-qPCR để định lượng chính xác mức độ nhiễm bệnh GAV trong các chuỗi mang và vỏ khác nhau được lấy mẫu từ từng cá thể P. monodon với việc nhiễm bệnh tự nhiên, để so sánh độ nhạy và biến đổi trong một trong hai loại mô. Để hiểu được GAV có thể thay đổi như thế nào trong các tình huống nhiễm bệnh tự nhiên, chứ không phải là nhiễm bệnh nhân tạo, chẳng hạn như kiểm tra tôm từ ao nuôi hoặc tôm bố mẹ tự nhiên – các nhà nghiên cứu sử dụng tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên. Các nhà nghiên cứu cũng lấy mẫu cả hai thùy cơ quan bạch huyết từ một tập hợp con P. monodon trưởng thành để so sánh độ nhạy của việc phát hiện GAV trong mô mang và vỏ, so với cơ quan bạch huyết, là mô mục tiêu đề xuất cho xác định GAV.
Tác giả chính của nghiên cứu được hỗ trợ bởi Học bổng Chương trình Đào tạo Nghiên cứu Chính phủ Úc và tài trợ cho nghiên cứu này có nguồn từ Chương trình Nghiên cứu Chuyển đổi Công nghiệp của Hội đồng Nghiên cứu Úc IH130200013.
Thiết lập nghiên cứu
Các nhà nghiên cứu lấy mẫu các mô từ hai nhóm độc lập P. monodon được nuôi dưỡng tại Trung tâm Nghiên cứu Bribie Island (BIRC), Queensland, Úc. Nhóm 1 bao gồm 10 con tôm nhỏ (trọng lượng trung bình là 10,9 ± 1,4 gram), và mỗi con tôm có tám sợi mang và tám vỏ tôm đã được lấy mẫu. Nhóm 2 có 12 con tôm trưởng thành (trọng lượng trung bình 40,4 ± 2,3 gram) và mỗi con có 10 sợi mang, 10 vỏ tôm và cả hai thùy ở bạch huyết được lấy mẫu. Mô được bảo quản cho đến khi được xử lý.
Hệ số biến thiên (CV) được sử dụng để xác định mô mang hoặc mô vỏ có khác biệt về mức độ biến đổi nhiễm GAV được phát hiện giữa các sợi mang cá thể và vỏ được lấy mẫu từ mỗi con tôm hay không
Kết quả và thảo luận
Việc quản lý các bệnh khác nhau có ảnh hưởng đến tôm nuôi phụ thuộc vào các phương pháp đáng tin cậy và chính xác để phát hiện và định lượng mức nhiễm bệnh. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng phương pháp RT-qPCR để định lượng và so sánh mức nhiễm GAV giữa các sợi mang cá thể, vỏ và thùy bạch huyết được lấy mẫu từ tôm sú tự nhiên bị nhiễm GAV.
Độ chính xác của các bản sao kỹ thuật nói chung là cao, ngoại trừ một số mẫu có mức nhiễm GAV rất thấp và có giá trị độ lệch chuẩn thay đổi nhiều hơn. Độ chính xác giảm có thể ảnh hưởng đến tính chính xác của việc phát hiện và định lượng mức nhiễm GAV.
Mức nhiễm GAV được phát hiện trong các sợi riêng lẻ và/hoặc vỏ được lấy mẫu từ mỗi tôm thường thay đổi nhiều hơn gấp 10 lần, và ở một số tôm lên đến khoảng 3.000 lần. Tỷ lệ biến đổi là hiển nhiên ở cả hai nhóm P. monodon bất kể mức độ nghiêm trọng của nhiễm GAV. Sự biến đổi mức nhiễm bệnh tương tự, bao gồm cả âm tính giả, đã được công nhận trong số các mẫu vỏ được lấy từ tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) bị nhiễm ở mức thấp với Virus Hội chứng đốm trắng (WSSV), và có thể xảy ra với các mầm bệnh tôm khác.
Kết quả của các nhà nghiên cứu nhấn mạnh tiềm năng của các mầm bệnh lây nhiễm bị bỏ qua khi sử dụng các mẫu đơn mô, đặc biệt là ở tôm có mức nhiễm bệnhtự nhiên ở mức độ thấp. Rất khó để dự đoán số lượng tối thiểu yêu cầu của mẫu mang hoặc mẫu vỏ, nhưng dựa trên tôm nhỏ trong nghiên cứu này, ví dụ, số lượng tối thiểu các mẫu mang hoặc mẫu vỏ cần thiết để đạt được tỷ lệ 100% tương ứng là năm và bảy mẫu. Ở tôm trưởng thành, một mẫu mô đơn lẻ sẽ đủ nếu tất cả các mẫu thử dương tính, nhấn mạnh tính đặc trưng của một số mẫu tối thiểu cho các nhóm được thử nghiệm.
Việc chẩn đoán sai bệnh có thể gây hậu quả nghiêm trọng trong các chương trình nhân giống tôm sú nơi tôm bố mẹ tự nhiên thường được chọn để nhân giống dựa trên xét nghiệm PCR âm tính đối với các tác nhân gây bệnh cụ thể (sạch bệnh SPF). Dữ liệu của các nhà nghiên cứu cho thấy rằng thử nghiệm một sợi lông mang hoặc vỏ có thể làm tăng nguy cơ âm tính giả đối với bệnh và bỏ qua bệnh, dẫn đến việc truyền mầm bệnh theo chiều dọc đến tôm giống và sau đó đến các ao nuôi hoặc tôm bố mẹ sạch bệnh khác.
Đối với tôm bố mẹ, việc thực hiện nhiều xét nghiệm PCR liên tiếp có thể thích hợp hơn, tốt nhất là sử dụng nhiều hơn 1 mẫu mô, trong quá trình kiểm dịch tôm bố mẹ tự nhiên trước khi chúng được chọn để sử dụng trong các chương trình nhân giống SPF. Hoặc là một phương án thay thế, tăng số lượng tôm được thử nghiệm để tăng tính chính xác của các ước tính tỷ lệ nhiễm bệnh khi xét nghiệm ở cấp quần thể.
Sự biến đổi lớn trong nhiễm GAV có thể xảy ra giữa các sợi mang hoặc vỏ ở một số tôm - ngoài việc phát hiện sai âm tính tiềm ẩn - có thể tạo ra dữ liệu không chính xác về mức nhiễm bệnh và có thể giảm thiểu mức độ nhiễm bệnh khi lấy mẫu một sợi mang hoặc một vỏ. Điều này có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của so sánh tương đối giữa tôm cá thể, bởi vì không có dữ liệu chính xác về mức nhiễm bệnh của mỗi con tôm, khả năng ước tính với bất kỳ sự đóng góp di truyền nào vào sự khác biệt giữa các cá nhân hoặc dòng họ sẽ bị thiếu nghiêm trọng.
Mức nhiễm GAV được định lượng trong mỗi thùy cơ quan bạch huyết từ tôm trưởng thành nhóm 2 cao hơn rõ rệt (435- 856 lần) và thay đổi rất ít so với vỏ hoặc sợi mang từ cùng một con tôm, nhất quán với các phân tích trước đây về tôm P. monodon nhiễm GAV với phát hiện có nồng độ GAV cao hơn trong cơ quan bạch huyết.
Mặc dù cơ quan bạch huyết là mẫu mô tối ưu để phát hiện sự nhạy cảm với GAV, có trường hợp lấy mẫu cơ quan này là không thích hợp, vì nó đòi hỏi phải giết con tôm (thường không phải là lựa chọn trong các tình huống nhân giống tôm), rất khó để lấy mẫu động vật nhỏ và nó có thể rất khó để xác định vị trí và mổ xẻ trong sàng lọc với số lượng vật liệu lớn. Do đó, các mô thay thế như mang và vỏ thường được sử dụng vì chúng có thể được lấy mẫu mà không gây hại đến tôm và hiệu quả trong hầu hết các kịch bản.
Do đó, dữ liệu của các nhà nghiên cứu cho thấy mô không thuận lợi hơn trong việc đưa ra dữ liệu chính xác về mức nhiễm GAV, vì vậy quyết định loại mô nào (vỏ hoặc mang) để lấy mẫu phụ thuộc vào quy trình thu thập và phòng thí nghiệm phù hợp nhất. Sự khác biệt về tổng số RNA được phân lập trên mỗi microgram mô có thể tồn tại và ảnh hưởng đến các so sánh tương đối giữa các loại mô.
Đánh giá
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đối với tôm nhiễm bệnh GAV tự nhiên đã chứng minh rằng mức nhiễm bệnh có thể khác nhau đáng kể giữa các sợi mang và vỏ khác nhau được lấy mẫu từ cùng một loại tôm. Do đó, thử nghiệm một mẫu đơn của các mô này có thể đánh giá thấp mức độ nghiêm trọng của bệnh hoặc thậm chí dẫn đến chẩn đoán sai một con tôm bị nhiễm bệnh.
Khi không thể lấy mẫu của cơ quan bạch huyết, việc thử nghiệm các nhóm mô từ hai hay nhiều sợi mang/vỏ được khuyến cáo thực hiện để vượt qua sự biến đổi này và tạo ra dữ liệu chính xác hơn về sự hiện diện và mức độ nghiêm trọng của nhiễm GAV.
HNN (Theo GAA)